Удалось проследить происхождение и развитие меланомы на первый раковых клеток

С пoмoщью мaркeр флуoрeсцeнтный, пoстрoeнный нa oснoвe рeгулирoвaния oблaсти гeнa xристиaнинoм рыбы дaниo-рeриo, группa учeныx из СШA, Швeйцaрии и Гeрмaнии прeслeдoвaли сaмыx рaнниx этaпoв зaрoждeния и рaзвития мeлaнoмы. Из мнoжeствa клeтoк, нeсущиx oнкoгeнныe мутaции, тoлькo нeкoтoрыe мoгут рoдить рaкa. Тaким oбрaзoм, гeнoм мeлaнoцитoв мнoгиe дoбрoкaчeствeнныe рoдинки или бoрoдaвки (нeвусoв) имeют oнкoгeнную мутaцию BRAFV600E, нo эти нeвусы рeдкo прeврaщaются в мeлaнoмы. Oкaзaлoсь, чтo к пoявлeнию злoкaчeствeнныx oпуxoлeй oтдeльныx мeлaнoцитoв пeрeпрoгрaммируются в свoe прeжнee сoстoяниe эмбриoнaльныx прeдшeствeнникoв. Удaлoсь тaкжe oпрeдeлить фaктoры трaнскрипции и рeмoдeлирoвaниe xрoмaтинa, связaнныe с прeoбрaзoвaниeм прeдрaспoлoжeн к рaку дoбрoкaчeствeнныx клeтoк в злoкaчeствeнныe.

Гeнeтичeский aппaрaт клеток обладает сложной системой регуляции деления, роста, дифференцировки и физиологической смерти клеток. Нормальное этих процессов, в том числе, чтобы предотвратить неконтролируемый рост клеток и образование раковых опухолей, регулируется, в основном, двух типов генов с противоположно ориентированных функций — протоонкогенами, стимулирующими рост клеток, и антионкогенами (генами-супрессорами опухолей) предотвращает чрезмерное увеличение (более чем в онкогенах и антионкогенах см. в новости На пути изучения каталога генов, «Элементы», 06.04.2015). Известно, что причина возникновения раковых клеток и опухолей в целом и меланомы в частности, являются мутации, активирует протоонкогены и/или инактивирующие гены-супрессоры опухолей. Эти ключевые события онкогенеза (см. генетические аспекты канцерогенеза) уже достаточно хорошо изучены. Но в процессе онкогенеза имеют место и другие события, молекулярных и участвуют механизмы, перепрограммирующие нормальных раковые клетки. Они все еще остаются недостаточно изученными.

Меланома является одним из очень агрессивные раковые опухоли — образуются в результате перерождения меланоцитов, клеток кожи, производящих пигмент меланин. Для изучения древнейших событий, которые имеют место при формировании меланомы, авторы обсудили работу провели эксперименты на рыбках данио-рерио (Danio rerio). Эти рыбы, вместе с мышами предпочтительны модели объекта исследования в эмбриологии и молекулярной биологии позвоночных.

В лаборатории ранее были получены трансгенные данио, которые несут мутант активированный протоонкоген человека BRAFV600E, которые часто встречаются в опухолях больных меланомой. Выражение BRAFV600E контролируется промотором mitfa, который работает только в меланоцитах. Если в геном рыбы, также отсутствовал активный антионкоген p53 (подробнее о нем см. в новости На пути изучения каталога генов, «Элементы», 06.04.2015), на ее теле появляются родинки и бородавки (невусы) и после нескольких месяцев развивалась меланома. Но, несмотря на многие невусов, меланома развивается только в некоторых из этих «ракоопасных» участков. Таким образом, авторы предположили, что для формирования меланомы важную роль играет еще один вид молекулярных событий, и были заняты их изучение.

Ранее с помощью гибридизации in situ было показано, что в меланомах опять начинает экспрессироваться эмбриональный ген рыбы данио-рерио христианином, какие мысли организму не свойственно. Функция гена и продукта пока не ясны, но известно, что в процессе эмбриогенеза свой продукт маркирует клетки-предшественники нервного гребня (neural crest progenitors, NCP), из которых развиваются меланоциты, и исчезает через 72 часа после оплодотворения. Эти данные заставили ученых построить ген-репортер на основе регулирования элементов генов христианином и использовать его для исследования самых ранних этапов формирования меланомы. Они определили элементы на регулирование этого гена в составе довольно большой фрагмент ДНК (4,5 тыс. пар нуклеотидов, p. н.), в сочетании с геном усиленного зеленый флуоресцентный белок (enhanced green fluorescent protein, EGFP) и ввели эту конструкцию в геном данио с помощью методов генной инженерии (рис. 2).

Рис. 2. Локус христианином и сконструированные на базе его регулирования, элементы, флуоресцентные репортеры. В верхней части — локус христианином (прототип). Показывает расположение LTRтакой последовательности нуклеотидов, U3-промотороподобной порядка и последовательности генов христианином, кодирующей белок. OTR (Open reading frame) — рамка считывания открытая, LTR (Long terminal repeat) — long terminal repeat. Ниже фрагменты длиной 4,5 тыс. p. n. и 1 тыс. p. n. используемые для построения журналисты — рекомбинантный промоторов гена христианина:EGFP. Белый фрагмент со стрелками — минимальный промотор гена β-глобина (см. Бета-globin). Рис. обсуждали статьи в Science

Было показано, что экспрессия EGFP с помощью этого искусственного элемента воспроизвести выражение гена христианином в эмбриогенезе данио-рерио и специально маркирует стволовые клетки и клетки-предшественники в формировании нервного гребня эмбриона и меланоцитов. Введение этот репортер позволило визуально фиксировать на данио происхождение и развитие меланом (данио-рерио в ранних стадиях развития, полностью прозрачны для видимого света, и это делает их легко моделей тела для исследований с использованием метки, люминесцентные). Удалось наблюдать, изолированные флуоресцирующие клетки задолго до формирования из них морфологически оформленные опухоли (рис. 1). Пересадка чешуи с таких синглов флуоресцирующими клетками в других частях тела данио из них развивались меланомы, прораставшие в гиподерму (самый нижний слой кожи). Следовательно, в таких случаях изолированных клеток, уже был инициирован опухоли.

Рекомбинантный репортер (промотор гена христианина:EGFP) позволила подробно изучить молекулярные механизмы, чтобы превратить потенциально онкогенных злокачественных клеток. Прежде всего, авторы выделили минимальный участок ДНК, который несет все регуляторные элементы генов христианина из клонированного ранее фрагмент длиной в 4,5 тыс. p. n. Вырезать слишком много, удалось снизить сначала до 1 тыс. п. н. (рис. 1), а затем до 296 p. n. (рис. 3). Биоинформатический анализ структуры этого участка длиной 296 p. n. обнаружил в ней последовательность нуклеотидов, которые являются участками связывания (Binding site) факторы транскрипции. В этих областях генов-репортер вводят инактивирующие мутации и заметил выражение EGFP под контролем мутантов участок в развивающемся эмбрионе данио.

Ряд экспериментов позволил определить степень важности различных веб-сайтов связывания и, соответственно, транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гена христианином в эмбриогенезе. Таким образом, веб-сайт дефект переплета pax3 на выражение гена христианином , практически не влиял, а дефекты, веб-сайтов, sox10, tfap2 и E-box — это очень подавляет (рис. 3). Эти результаты предполагают, что выражение репортер регулируется факторами транскрипции, конкретных развития нервного гребня.

Рис. 3. Мутации в участках для признания факторов регуляции транскрипции sox10, tfap2 и E-box/тус (mitf), связанных с эмбриогенезом нервного гребешка, существенно снижают уровень специфического выражения репортер (промоутер гена христианина:EGFP), длина 296 p. n. в эмбрионах 24 часа после оплодотворения. Мутации в гипотетической сайт pax3 на нем, практически, не влияет. В экспериментах по трансплантации был использован на 80 и более эмбрионов. Общая впрыска с корреспондентом ubi:mCh — проводилась, как и контроль успешной трансплантации. Справа представлена доля эмбрионов с указанным типом экспрессии репортера христианина:EGFP длина 296 p. n. Эктопические — неспецифическая выражение. Neural Crest — задает выражение в нервном гребешке. NC+эст — совместное выражение. Рис. обсуждали статьи в Science

Анализ спектра и уровня экспрессии большой набор генов в первые EGFP+-голосования путем гибридизации на чипах подтверждения количественной ПЦР с обратной транскрипцией показал, что происхождение меланомы возрождаются молекулярных событий и профиль экспрессии генов, присущие предкам нервного гребня (NCP). Искусственное усиление экспрессии гена sox10 в меланоцитах экспериментальных данио резко ускоряло появление и развитие меланом, а подавление замедляло эти процессы.

Была также изучена регуляции экспрессии генов нервного гребня эмбриона на эпигенетическом уровне (вызванных механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК; в этом случае, изменения хроматина), а затем по сравнению с таковой в курс обучения меланоме. Участки хроматина с высоким содержанием гистона H3 (Histone H3), ацетилированного, в соответствии с положением K27 (H3K27Ac) (см. модификации гистонов, Modifications to histones), известны как суперэнхансеры (Super-enhancer,). Они являются ключевыми факторами транскрипции, которые регулируют экспрессию генов, специфических для данного типа клеток или раковых клеток.

Для характеристики суперэнхансеров применять методику иммунопреципитации фрагментов хроматина с антителами к Н3К27Ас и последующим качественным и количественным определением нуклеотидной посдедовательности ДНК в преципитированных фрагменты. Для анализа профиля генов, открытых передовые выражение, применяется также метод АТАКИ-секвенирования (ATAC-seq). Результаты, полученные с помощью обоих подходов показали сходство набор активно экспрессирующихся генов на ранних стадиях развития меланомы и формирование нервного гребня (рис. 4).

Рис. 4. Общая модель инициирования меланомы в результате «возвращения» меланоциты в состояние предшественники нервного гребня (NCP) как следствие, чтобы активировать супер-энхансеров (Super-enhancer,). В нормальной ткани генетические происходят события, которые приводят к активации онкогенов (BRAFV600E) и инактивации супрессоров (р53–/–). В результате преодолевается «барьер » нормальности» и появляются «ракоопасные» области. В этих областях отдельные клетки проходят еще один барьер — вернулся в состояние предшественники нервного гребня (NCP) и инициирует формирование меланомы. Подавление процесса возврата медикаментозными или другими средствами может блокировать начало меланомы. Рис. обсуждали статьи в Science

Таким образом, показано, что, помимо мутации протоонкогенов и антионкогенов, дополнительно, важным событием для возникновения меланомы является возвращение клеток меланоцитов, их состояние эмбриональных предшественников (fig. 5).

Рис. 5. Перепрограммирование меланоцитов приводит к злокачественной трансформации клеток. Во время развития эмбриона рыбы данио в какой нервного гребня (NCP) имеет место выражение гена христианином (отмечен зеленым), которая регулируется специальным набором факторов транскрипции. Затем NCP мигрируют и превращаются в меланоциты (серый), выражение гена христианином прекращается. В модели данио BRAFV600E/p53–/–-меланоциты экспрессируют онкоген, но лишь немногие из них начинают экспрессировать христианином и дают начало инвазивной меланоме. Это происходит случайно обратного перепрограммирования, в ходе которой, из-за активации суперэнхансеров ряд генов эмбриогенеза меланоциты, которые несут онкогены, «вернуться» в состояние, подобное NCP. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Science

Вероятно, такие события имеют место в развитии многих раков. Описанное перепрограммирование, в принципе, открывает новые возможности для диагностики рака и для поиска новых мишеней противораковой терапии — с целью заблокировать этот процесс. Но ряд важных вопросов остается нерешенным. Например, насколько важным для инициирования опухоли является формирование ее специфического микроокружения («ниши») и как это происходит? Важно также, через описанный маркер флуоресцентный, чтобы отслеживать, как меланома превращается в инвазивную опухоль, которые являются дополнительными факторами транскрипции, эпигенетические регуляторы и сигнальные пути могут быть необходимы для инициации и прогрессии опухоли. Также, следует отметить, что коллеги гена христианином, данио-рерио, ни мышей, ни один человек не был найден. Обнаружение таких маркеров эмбриогенеза позволило бы детально изучить ранней стадии формирования раковых опухолей в организме человека.

Источники:

1) Чарльз К. Кауфман, Христианский Mosimann, День Пэн Фань, Сун Ян, Эндрю Дж. Томас, Жюльен Ablain, Джастин L. Tan, Рэйчел D. Fogley, Ellen van Rooijen, Elliott J. Hagedorn, Кристи Ciarlo, Richard M. White, Доминик A. Matos, Ann-Christin Съемник, Кристина Santoriello, Эрик C. Liao, Ричард А. Янг, Леонард I. Zon. Чтобы zebrafish melanoma модель reveals появление of neural crest identity during melanoma initiation // Science. 2016. DOI: 10.1126/science.aad2197.

2) Soufiane Boumahdi, Cedric Blanpain. Tracking the origins of tumorigenesis // Science. 2016. Ст. 51. P. 453-454. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье в Science.)

Вячеслав Калинин

Комментирование и размещение ссылок запрещено.

Комментарии закрыты.