Новости искусства

Систeмa нaслeдству, приoбрeтeннoгo иммунитeтa CRISPR-Cas, рaспрoстрaнeннoй в прoкaриoт, зaщищaeт свoиx oблaдaтeлeй oт вирусoв. Oднaкo, вирусы, пoстoяннo мутируя, спoсoбeн быстрo (инoгдa мeнee, чeм зa дeнь), чтoбы прeoдoлeть иммунитeт ни oднoй жeртвы. Кaк oкaзaлoсь, эффeктивнoсть систeмы CRISPR oбeспeчивaeтся тeм, чтo в свoeй дeятeльнoсти рaзличныe бaктeрии учaтся рaспoзнaвaть вирус из рaзныx учaсткoв eгo гeнoмa. В рeзультaтe спoсoбы, чтoбы зaщитить бaктeрии oт этoгo вирусa стaнoвится нaстoлькo рaзнooбрaзнoй, чтo ни oднa тoчкa мутaции нe пoмoжeт, вирусы эффeктивнo aдaптирoвaться к кoллeктивнoй oбoрoнe жeртв. Этo, в свoю oчeрeдь, внoсит свoй вклaд в рaзвитиe спeциaльныx вирусныx гeнoв, пoдaвляющиx aктивнoсть систeмы CRISPR, в цeлoм, бaктeрии рeaгируют нa тaкoe рaзвитиe сoбытий, нoвыe функции систeмы CRISPR — нo тaкиe измeнeния трeбуют бoльшe врeмeни.

Рaбoтa систeмы CRISPR-Cas oснoвaн нa том, что небольшой фрагмент, вырезанный из проникают в клетки бактериальной гетерогенной (например, вирусной) ДНК, вставляется в специальный раздел (локус CRISPR) генома бактерий. Каждый локус CRISPR содержит много таких вставок («спейсеров») — представляет собой кусочки наследственного материала паразитов (вирусы, плазмиды, подвижных элементов). На основе спейсеров синтезируются молекулы РНК, комплементарные участку генома паразита. Эти РНК в комплексе с белками Cas, которые затем используются для идентификации и нейтрализации чужеродных ДНК с одинаковой последовательностью нуклеотидов. Таким образом, если в клетке в один день, проникла вирусная ДНК, но клетка ухитрилась выжить и встроила кусок вирусного генома в хромосомы, то последующие попытки же вирус заразить этой клетки или ее потомков будут пресекаться быстро и эффективно (более подробный рассказ о системе CRISPR читатель найдет ссылки указаны в конце новости).

Тем не менее, вирусы не склонны долго оставаться «так». Через случайные мутации и отбор могут обойти системы защиты жертв. Этот спейсер и потерял эффективность, достаточно создать ему фрагмент вирусного генома, по крайней мере, только немного изменилась. Поэтому вирусы успешно, и, иногда, очень быстро преодолевают приобрел иммунитет бактерий через точку мутации. С другой стороны, система CRISPR очень широко распространены на прокариот и, по-видимому, предлагают своим обладателям надежную защиту. Что позволяет этих систем, чтобы конкурировать на равных с быстро эволюционирующих паразитов?

Генетики и микробиологи Великобритании, Франции и США показали, что важный вклад в эффективность CRISPR способствует тот факт, что в ответ на один и тот же вирусная инфекция, даже генетически идентичные клетки бактериальной, вставленные в геном его различные спейсеры, соответствующие различных участков генома вируса. В результате, население жертв быстро приобретает генетическое разнообразие, что значительно усложняет стоя перед вирусами эволюционная задача. Покупая точечную мутацию, которая защищает от spacer, вирусы могут заразить только небольшая часть населения жертв. К счастью для бактерий, бактериофагов не может определить заранее, что спейсеры доступны для этой клетки: это станет ясно только тогда, когда он впрыснет в нее ДНК, то будет уже слишком поздно передумывать. Таким образом, большинство фагов в население жертв, осужденное к смертной казни, даже если не фагов, а затем возникают точечные мутации, которые защищают против spacer. Чтобы защитить себя сразу много различных спейсеров, фагу нужно одновременно приобрести целый комплекс необходимых точку мутации, что крайне маловероятно, потому что мутации случайные.

Проверка этих предположений была проведена бактерий синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) и фагах DMS3vir. Для начала, авторы показали, что система CRISPR действительно защищает бактерии от этого сорта фагов. В популяциях диких бактерий привели исследователей фаги полностью исчезли всего за 5 дней. В культурах бактерий отключена система CRISPR вирусы чувствовать себя вольготнее: 30 дней, пока длился эксперимент, вирусы никуда не исчезли ни в одной из линий. В первом случае, все бактерии, как и ожидалось, были разработаны наследуемый приобретенного иммунитета на основе CRISPR. Бактерии в когда выключен, система CRISPR также разработали некоторые защиты, но на другой основе: они распространились мутации, которые меняют поверхность белка приемник, который цепляется за фаг, чтобы заразить клетку. Казалось бы, второй способ оказался менее эффективным, и не их популяциям полностью избавиться от паразитов, так как они сделали-население, которое работает под управлением операционной системы CRISPR.

Авторы подчеркивают, что полное исчезновение вируса в популяции дикого типа является неожиданным результатом, так как известно, что вирусы, в принципе, могут пройти CRISPR-иммунитет с помощью точки мутации. Может быть, все дело в различных спейсеров, состоящих из бактерий в каждом из экспериментов популяции? То, что спейсеры действительно получаются разные, было показано в предыдущих экспериментах. Теперь нужно было доказать, что это разнообразие способствует коллективной деятельности иммунной защиты. Для этого необходимо сравнить устойчивость вирусов в популяциях с разным уровнем разнообразия спейсеров.

Для того, чтобы получить такой популяции, авторы взяли их подопытные линии выигрышных вирусов с помощью CRISPR, и вывести из них 48 индивидуальных клонов (которое берется из 48 отдельных клеток, и получил от каждого многочисленное потомство). Ученые ожидалось (и эти ожидания, впоследствии подтвердились), что спейсеры все или почти все клоны будут разными. Затем из этих клонов были составлены населения пяти видов, которые отличаются по уровню генетического разнообразия: население из-клон (монокультура) и групп населения, смешанных, состоящих из 6, 12, 24 и 48 клонов.

Эти народы тогда были подвержены заражению вирусами. На этот раз, ученые были заинтересованы в первую очередь эволюция вирусов, а именно их способность преодолевать систему защиты жертв. Таким образом, наблюдения длилась всего 3 дня — достаточно времени для заметных эволюционных изменений от вирусов, но недостаточно, чтобы подопытные популяции бактерий, удалось путем создания новых спейсеры, выровняться на уровне генетического разнообразия.

Результаты подтвердили ожидания авторов. В течение трех дней, вирусы полностью исчезли во всех популяций жертв, состоящих из 24 и 48 клонов, и во многих популяциях, состоящих из 12 клонов. В различных популяциях, состоящих из одного или шесть клонов, вирусы в большинстве случаев выжили.

Каждые несколько часов в течение трех дней эксперимента часть вируса изымалась для детального анализа. Фагов послушными полногеномному секвенированию, и, также, реализована в чистые культуры каждого из 48 клонов бактерий, чтобы увидеть, в каких случаях вирусы научились, чтобы преодолеть систему защиты жертв.

Оказалось, что те вирусы, которые по три дня превратилась в монокультурах бактерий, в большинстве случаев, закрепились мутации, которые делают соответствующие спейсер неэффективными. И произошло это, как правило, уже в первый день. Только пять из 48 монокультур вирусов не удалось справиться. Как оказалось, в трех случаях из этих пяти бактерий образовался не один, а два или более противовирусных спейсеров.

От вирусов, которые развивались в популяциях бактериальных, состоящие из 6 и 12 клонов, сопротивление или другим спейсерам сформировалась лишь в немногих случаях. Ну, и те бедолаги, которые должны были развиваться в самых различных популяций жертв, состоящих из 24 и 48 клонов, не научились, чтобы преодолеть защиту, ни один из источник клонов (рис. 2).

Рис. 2. Генетическое разнообразие жертв предотвращает вирусов, чтобы преодолеть их иммунной защиты. Рисунок показывает результаты экспериментов от заражения вирусами, коэволюционировавшими с различных популяциях бактерий, каждый из 48 источник бактериальных клонов. Каждый из пяти столбцов соответствует ряд экспериментов с одним из пяти уровней, разнообразие жертв (слева направо: 1 клон, 6, 12, 24, 48 клонов). В каждом эксперименте вирус для анализа брали позже 0, 16, 24, 40, 48, 64 и 72 часа после заражения (6 рядов вертикальных внутри каждой из колонн; внизу подписано времени в день после заражения — d.p.i.). Каждой порции, полученных таким образом, вирус внедряется в культуру чистой каждый из 48 клонов бактерий и забыл, если вирусы размножиться (красные квадраты) или исчезновения (зеленые квадраты). Толстые черные горизонтальные линии , разделенные повторности, который отличается от подопытные населения с высоким уровнем разнообразия. Рисунок показывает, что в монокультурах бактерий, вирусов в большинстве случаев больше одного дня, они научились, чтобы преодолеть систему защиты; в популяции в 6 и 12 клонов, это происходит редко, в популяциях из 24 и 48 клонов — никогда. Рисунок обсуждали статью в Nature

Причина, конечно, не в том, что эти вирусы «правильные» мутации появились заочное. Мутагенез, скорее всего, проходила в равной мере на все вирусы. Только в монокультуре единичная мутация, которая обеспечивает защиту от этого spacer, сразу дает вирусу большое преимущество, так как позволяет заражать все бактерии), а население культура 48 клонов точно такая же мутация обеспечит вирус-мутанту успеха только с вероятностью 1/48. Даже если ему невероятно повезло, и он впрыснет свою ДНК в бактерии, от которого spacer сейчас защищен, его потомки, снова столкнется с той же проблемой. И она будет только ухудшаться по мере сокращения числа бактериальный клон, который стал уязвимым. Однако, прежде чем это, как правило, даже не это: выбор практически не поддерживает от вирусов точечные мутации, которая защищает от некоторых спейсеров, и вирусы находятся на грани исчезновения, так и не имеют времени, чтобы преодолеть оборону ни один из 48 клонов.

Эти выводы подтверждаются тем, что число мутаций, обнаруженных в геноме вируса, эволюционировавших в монокультурах жертв, был значительно выше, чем вирус, эволюционировавших в смешанных культур: в первом случае, выбор поддержали вирусов полезные мутации, а во втором нет. Кроме того, было доказано, что бактерии из смешанных культур в течение трех дней, не приобрели новых противовирусных спейсеров, в то время как в монокультурах такие спейсеры появился. Это также логично: в смешанных культур бактерий, опасных вирусов так и не появилось, а в монокультурах появились вирусы, пробивающие старые защиты и системы CRISPR-создал дополнительные спейсеры.

Таким образом, различные спейсеров, порождаемое системой CRISPR, действительно вносит важный вклад в ее эффективность. Если на все инфекции системы реагирования путем создания одного и того же spacer все бактерии, вирусы легко справились бы с такой иммунитет. Но так как спейсеры каждый раз получаются разными, точечные, мутации и отбора, становятся для вирусов не является достаточно эффективной стратегии эволюционного.

Это объясняет эффективность системы CRISPR и распространена на прокариот. Осталось понять, почему бактериофаги, еще не исчезли, раз эта система так же хорошо. Ответ на этот вопрос отчасти уже известен: в последнее время я фагов были обнаружены гены, специальные, которые тормозят систему CRISPR как таковой (см.: J. Bondy-Denomy et al., 2013. Бактериофаг разработка генов, что инактивация the CRISPR/Cas бактерии immune system). В связи с этим возникает следующий вопрос: если есть вирусные гены, полностью выводящие из строя CRISPR, то, что все вирусы не имеют их? И что бактерии могут эти гены против? Тем не менее, ответ на этот вопрос также уже частично известно: есть много различных вариантов системы CRISPR, каждый из которых уязвим только для некоторых вариантов генов анти-CRISPR и защищен от других. И содержит в геноме куча дополнительных генов — дорого для вирусов, и выбор, как правило, поддерживает компактизацию генома (это увеличивает скорость размножения вируса).

Казалось бы, антагонистическая коэволюция (гонка вооружений) между фагами и бактериями идет параллельно на разных уровнях и в разные промежутки времени. Формирование новых спейсеров и разработка вирусов точки мутации, которые делают этот спейсер неэффективно, занимает всего несколько дней или даже часов. Разработка новых генов анти-CRISPR или новых вариантов системы CRISPR, неуязвимых для этих генов, вероятно, нужны тысячи и миллионы лет (хотя в мире вирусов и микробов, все, что было кем-то однажды придуманный, а затем может быстро передаваться из рук в руки путем горизонтального переноса). Конца этой гонке не ожидается, и маловероятно, что кто-то выйдет из этого «победителя». Тем не менее, знание ее механизмов, позволят людям в будущем, по крайней мере, частично, взять его под свой контроль.

Источник: Stineke van Houte, Alice K. E. Ekroth, Jenny M. Broniewski, Hélène Chabas, Бен Эшби, Джозеф Bondy-Denomy, Сильвен Gandon, Майк Boots, Стив Патерсон, Ангус Buckling & Edze R. Westra. The diversity-в состоянии генерировать benefits of prokaryotic adaptive immune system // Природа. 2016. DOI: 10.1038/nature17436.

См. также, о системе CRISPR:

1) Бактерии наследуют приобретенный иммунитет, «Элементы», 21.01.2010.

2) иммунитет, Приобретенный от бактерий может быть связан с механизмами РНК-интерференции, «Элементы», 6.04.2011.

3) Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном, «Элементы», 12.03.2013.

О коэволюции паразитов и хозяев:

1) С паразитами не обязательно бороться, он может адаптироваться, «Элементы», 7.11.2007.

2) Современные паразитов, опасных прошлого и будущего, «Элементы», 12.12.2007.

3) Муравьи стараются не пахнуть как гусеницы, пахнущие как муравьи, «Элементы», 10.01.2008.

4) Амебы-мутанты не позволяют себя обманывать, «Элементы», 6.10.2009.

5) Коловратки спасаются от паразитов, перелетая в другие водоемы, «Элементы», 2.02.2010.

6) Гонка вооружений — двигатель эволюции, «Элементы», 1.03.2010.

7) Бактериальная инфекция приводит к необратимой потере полового размножения, «Элементы», 9.09.2010.

8) Разнообразие тропических насекомых поддерживается узкой специализации паразиты, «Элементы», 18.03.2014.

9) Различные стратегии защиты приводит к разному эволюционному отклику, «Элементы», 10.06.2015.

Александр Марков