Новости искусства

Сoтрудники институтa Крeйг Вeнтeр сooбщил o тoм, чтo успex нa пути сoздaния искусствeнныx микрooргaнизмoв сo свoйствaми укaзaнныx. Испoльзуя рaзрaбoтaнныe рaнee мeтoды прoизвoдствa синтeтичeскиx гeнoмoв и иx внeдрeниe в бaктeриaльныx клeтoк, исслeдoвaтeли сoздaли жизнeспoсoбныe бaктeрии, гeнoм кoтoрoй сoдeржит всeгo 531 тысячу пaр oснoвaний и 473 гeнoв — мeньшe, чeм любoй сущeствующий в прирoдe микрooргaнизмoв, спoсoбныx сaмo-вoспрoизвoдствa. В xoдe рaбoты стaлo яснo, чтo сoврeмeнныe знaния oб устрoйствe клeтки и функции гeнoв eщe нeдoстaтoчнo для прoeктирoвaния гeнoм с нуля, тaким oбрaзoм, бeз мeтoдa прoб и oшибoк сдeлaть пoкa нe мoжeт. Oсoбeннoсти 149 oт 473 гeнoв «минимaльнoгo гeнoмa» нeизвeстными»: экспeримeнты пoкaзaли, чтo эти гeны нeoбxoдимы для устoйчивoгo рoстa бaктeрий, нo чтo имeннo oни дeлaют, eщe прeдстoит выяснить.

Крeйг Вeнтeр (John Craig Venter) и сoтрудники сoздaннoгo им институтa (J. Craig Venter Institute) сдeлaлa eщe oдин вaжный шaг нa пути к свoeй глaвнoй цeли — создание искусственных микробов с желаемых свойств.

К этой цели Крейг Вентер и его коллеги методично движется более 20 лет, начиная с чтения в 1995 г. генома бактерии Mycoplasma genitalium — организма, который имеет самый маленький геном из всех живых существ, способных к самостоятельной репликации (внутриклеточных паразитов и облигатные симбионты вроде Nanoarchaeum не имеет значения, потому что они пользуются для размножения, услуги в чужой клетки, которые позволили бы им уменьшить свой геном, по крайней мере, до нуля).

У M. genitalium в геноме лишь 583 тыс. пар оснований (п. о.) и 525 генов. Тем не менее, эта бактерия размножается стандартам микробиологические очень медленно (удваивает число 16 часов), и экспериментировать с ней неудобно. Поэтому исследователи используют в качестве основного объекта другой микоплазму, Mycolasma mycoides. Ее геном в два раза больше, но и умножает это в 16 раз быстрее.

В новой реализации Крейга Вентера и его команды основывается на предыдущих революционных прорыва, которые будут объяснены в новости Первая в мире операция по пересадке генома позволила превратить один вид бактерий в другой («Элементы», 02.07.2007) и Создано первое живое существо с синтетическим геномом («Элементы», 25.05.2010). В обсудили деятельность за основу был взят изготовлен ранее штамм с синтетическим геномом M. mycoides JCVI-syn1.0 (сокращенно syn1.0). Геном этой бактерии содержит 1 078 809 п. о. и почти не отличается от природного прототипа — генома диких M. mycoides, за исключением нескольких «арбуз» — последовательности, в которой ученые зашифровали нуклеотидным кодом их имена и адреса. По словам Крейга Вентера, таких как вставки делать, должен синтетических микробов всегда можно было отличить от природных.

Ключевым этапом на пути к проектируемым организмов, чтобы определить минимальный набор генов, необходимых для жизни клетки. Речь идет, конечно, о жизни в безупречных лабораторных условиях, но, тем не менее, о жизни в автономном режиме, то есть без помощи других живых клеток. Давно известно, что даже на бактерии, с очень маленькими геномами, такие как M. genitalium, в идеальных условиях и неизменные условия, многие гены являются избыточными. Таким образом, любой природный геном может быть резко сокращен. Решение этой проблемы заключается не только в том, чтобы дать будущим дизайнерам оптимальной отправной точкой, но и дать более глубокое понимание основных принципов функционирования клетки. Именно эту цель и поставили перед собой авторы обсуждаемой статьи.

На первый взгляд, задача, кажется, не так сложно, но это ложное впечатление. Очевидно, способ, подход — сравнить геном различных групп микробов, и найти гены, которые есть у всех, без исключения. К сожалению, этот метод не работает: «минимальный набор», который можно определить с его помощью, состоит из около 250 генов, и, очевидно, не является достаточно большим для жизни клетки. Тот факт, что многие важные функции могут с успехом выполнять разными, непохожими друг на друга генов. Таким образом, в геноме каждого микроба есть гены, не сверхконсервативными (то есть отсутствие многих других микробов), но совершенно необходимых. В результате, для того, чтобы разработать минимальный геном, необходимо в точности знать функции каждого из генов и полный набор необходимых для жизни функций, или потратить огромную экспериментальную работу по определению минимального набора генов, путем проб и ошибок.

Прежде всего, авторы пытались пойти первым путем и разработать минимальный геном чисто теоретически, опираясь, что наука уже накопила достаточно знаний о принципах работы живых клеток и о функциях генов. Расчет был, в частности, от того, что плохо изучены гены не являются жизненно важными.

Исследователи удалили из геномного текст синтетической бактерии» syn1.0 все, что ему казалось, они лишние на основе полученных знаний молекулярной биологии. Оставлены были только набор генов (и, в то же время, очень важные) функции, а также те, для которых имелись экспериментальные данные, которые свидетельствуют о их незаменимости.

Разработан таким образом «гипотетический минимальный геном» был изготовлен из синтетических олигонуклеотидов, собрать и внедряется в клетки микоплазм с помощью методов, описанных в новости Создано первое живое существо с синтетическим геномом («Элементы», 25.05.2010). Но фокус не удался: искусственный геном не мог обеспечить выживание клеток. Разделив его на восемь равных частей, и, наблюдая каждую в отдельности (в сочетании с 7/8 источником генома syn1.0), авторы обнаружили, что только один из восьми фрагментов был разработан без фатальных ошибок, да и в ней тоже что-то не так, потому что клетки с этот фрагмент, хотя и не умер, но росли очень медленно.

Провал заставил авторов пересмотреть свое мнение о степени развития современных биологических знаний и прибегая к старым добрым методом проб и ошибок. Каждый раз, когда они синтезировали геном с теми или другими отредактированными фрагменты, вставьте их в ячейки и смотрит, что происходит. К счастью, методы, разработанные для того, чтобы сделать syn1.0 и, впоследствии, значительно улучшилось вместе с улучшением методологии транспозонного мутагенеза (см.: Transposon mutagenesis), позволило выполнить это за обозримое время. Авторы сообщили, что в настоящее время на весь цикл производства-от компьютерного проекта до готового синтетического генома длится менее трех недель: почти в 100 раз меньше, чем ушло на создание первого генома синтетический, работа над которой завершилась в 2008 году.

Вместо попыток грубо разделить ресницы syn1.0 «необходимые» и «избыточные» авторы разработали классификация более тонкий, что отражает тот факт, что, кроме абсолютно необходимых для жизни генов есть много таких, без которых, на первый взгляд, можно сделать, однако, их удаление замедляет рост клеток, а если удалить несколько таких «квази-требуется» (quasi-essential) генов, клетка может вообще погибнуть.

Восемь восьмушек генома, предназначенные снова в виду этот аспект, оказались совместимыми с жизнью каждого в отдельности (то есть в сочетании с другими семи нот восьмой источником генома syn1.0), но все вместе, они снова были нежизнеспособными. На этот раз причиной было то, что некоторые нужные функции проводятся два сменных генов, расположенных в различных восьмушках. В ходе индивидуальной проверки каждого из этих генов был классифицирован как «излишки», потому что функция успешно справились второго гена. Однако, одновременное удаление обоих генов оказалось фатальным. Для того, чтобы очистить эти ошибки, ученые имели много времени, чтобы учиться методом транспозонного мутагенеза промежуточных штаммов, которые имеют несколько фрагментов генома был атакован, а остальные хранятся в оригинале. Вылавливались гены без изменений частей, которые, таким образом, стебли стали незаменимыми, хотя и не были настроены на syn1.0. В конечном итоге удалось составить список из пары генов, из которых можно удалить один, но не оба.

Когда эта и многие другие трудности были, наконец, преодолены, на свет появился синтетический микроб syn3.0 (имя syn2.0 i-вернулся один из промежуточных результатов работы) — победитель и самый маленький геном из всех клеточных форм жизни, способных к самостоятельной репликации. Его геном является лучшим на сегодняшний день, придя к идеалу «минимальный геном» (рис. 2).

Рис. 2. Слева — технологии изготовления минимального генома: цикл «Дизайн-Монтаж — Испытания» (Design — Build — Test). Геномные тексты предназначены на компьютер (Дизайн), а затем производятся синтетические короткие фрагменты — олигонуклеотиды (Synthesis), из которых с помощью сложного многоступенчатого процесса планируете генома (Construction). Этот геном размножается в клетках дрожжей (Клонированные), выделяется в чистом виде (Isolation) и добавить в культуру клеток Mycoplasma capricolum, из которых некоторые заглатывают эти геномы (Трансплантации), а затем делятся, передавая частей, их потомки, только синтетический геном. Остается проверить, что такое потомство жизнеспособным и оценить их скорость размножения (Нароста). Справа — исходный геном syn1.0 (внешний круг) и изготовлен на основе минимального генома syn3.0 (внутреннее кольцо). Изображение из обсуждаемых в статье в Science

Геном syn3.0 значительно меньше, чем у предыдущего рекордсмена M. genitalium: он содержит 531 490 п. о., 438 белок-кодирующих генов и 35 гены функциональных РНК. В этом syn3.0 распространяется в пять раз быстрее, чем M. genitalium (но, тем не менее, в три раза медленнее, чем syn1.0), тиражирование в количестве трех часов. Авторы могли устранить некоторые «квази-необходимые» генов, жертвуя скоростью роста, но решили не делать этого, чтобы не помешать себе в дальнейшем работу.

Что является результатом «минимальный геном»? От 901 гена syn1.0 была удалена почти половина (428). Среди удаленных преобладают гены белков с неизвестными функциями, ресницы липопротеинов, подвижные элементы, но, кроме того, гены, связанные с теми аспектами метаболизма, которые не нужны для жизни в лабораторных условиях на питательной среде, которая содержит все необходимые бактерии малых молекул. Например, потому что в этой среде много глюкозы, большинство генов, связанных с транспортом и метаболизмом других сахаров, удалось безболезненно удалить, оставив только гены, необходимые для поглощения и усвоения глюкозы.

Среди генов, оставшиеся от syn3.0, доминируют гены, связанные с сохранением, размножением и считывания генетической информации (ремонт, репликация, транскрипция, трансляция), с ячейки дивизии, и, также, гены мембранных белков. Потому что syn3.0 не способен синтезировать аминокислоты, нуклеотиды, витамины и другие малые молекулы, она должна получать все от среды, а для этого нужна транспортных белков, расположенных в клеточной мембране.

Самое интересное, что о функции большая часть генов syn3.0 мало что известно. Для 65 генов из 473 функция неизвестна даже для 84 он может только смутно догадываться по сходству аминокислотной последовательности исследуемых белков других организмов. Многие из этих загадочных генов есть родственники (также с функцией неизвестной) в геном других организмов — от архей до Homo sapiens. Видимо, они действительно выполняют в клетке какой-то очень важные, но не расшифрованные варианты. Это показывает, насколько неполным наши знания об устройстве живых клеток.

Появление новых микробов, также преподнес сюрпризов (рис. 3). В жидкой среде бактерии syn3.0, в отличие от syn1.0, не плавать в одиночку, и оседают на дно, где образуют биопленки с различными структурами, выстраиваясь аккуратными рядами, раздуваясь или в смеси в большой пузырь. Кроме того, в скоплениях syn3.0 кроме того, клетки обычных размеров (0,5–1,0 мкм) присутствует много мелких вещей, и, казалось бы, жизнеспособных (живых клеток, способных образовывать новые колонии, проходят через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм). Вероятно, в процессе редактирования генома исследователи устранили некоторые гены, обеспечивающие устойчивость развития, стабилизации, процессе деления клеток или структуры мембран, что привело к увеличению случайной изменчивости клеток. Авторы сообщили, что аналогичные фенотипы наблюдались ранее в некоторых микоплазм при выращивании в условиях нестандартных, в которые могли бы изменить процессы синтеза липидов и свойства мембран.

Рис. 3. Внешний вид колоний syn1.0 и syn3.0. В жидкой среде клетки syn1.0 плавающие в стороны (влево вверх), в то время как syn3.0 поселиться в нижней части (справа вверху), где образуют биопленки с многоклеточными нитчатыми структурами (белые стрелки) и непонятно большие пузыри (черные стрелки). Для клетки syn3.0, кроме того, характерен широкий диапазон изменчивости размеров (внизу). Длина масштабных отрезков: 10 мкм (первые фото) и 1 мкм (нижние фотографии). Изображение из обсуждаемых в статье в Science

Крейг Вентер и его коллеги, наконец, еще поэкспериментировали с геном syn3.0, переставляя гены с места на место (много генов удалось группы функций, которые должны облегчить работу будущих дизайнеров), заменив в кодоны генов на синонимичные и способствуя однонуклеотидные замены жизненно важных генов рибосомных РНК. Все это не влияет на жизнеспособность искусственного микроба, который, таким образом, сохранил определенный уровень генетической пластичности и может быть подвергнут дополнительной оптимизации.

Это знаменует важную веху в развитии биотехнологий. В том случае, если первая бактерия с синтетическим геномом, syn1.0, на самом деле мало отличалась от естественной бактерии Mycoplasma mycoides, возбудитель пневмонии коров, а затем о новый микроб syn3.0 это не может сказать. Наследственной информации M. mycoides осталась только половина генов переставлены, кодоны изменены, фенотип клеток, также изменилась. Вероятно, можно сказать, что syn3.0 — это не только владелец и самый маленький геном из всех один, размножающихся живых существ, но и тело, будучи самым радикальным искусственной генетической модификации. Кроме того, она генома изначально собранный из химически синтезированных олигонулеотидов на основе информационных проектов. Разработанная авторами мощная система DBT (Design — Build — Test, рис. 2) используется в этом случае для того, чтобы сделать микроб с минимального генома, но в конце концов, они могут быть с успехом применены для оптимизации бактерий из многих других (потенциально — почти все) варианты. Кажется, в самом деле, человечество стоит на пороге эры конструкции конкретных живых существ с желаемых свойств.

Источник: Clyde A. Hutchison III, Ray-Юань Чжуан, Владимир Н. Носков, Nacyra Виктор-Гарсия, Томас Дж. Deerinck, Mark H. Ellisman, Джон Гилл, Кришна Kannan, Богумил J. capo bay, Ли Ма, Джеймс F. Хизер, Zhi Цин Ци, R. Alexander Richter, Elizabeth A. Strychalski, Понимая, Sun Йо Suzuki, Billyana Tsvetanova, Kim S. Wise, Hamilton O. Smith, John I. Glass, Чак Мерриман, Daniel G. Gibson, J. Крейг Вентер. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. 2016. Ст. 351. DOI: 10.1126/science.aad6253.

См. также:

1) Первая в мире операция по пересадке генома позволила превратить один вид бактерий в другой, «Элементы», 02.07.2007.

2) Создал первое живое существо с синтетическим геном, «Элементы», 25.05.2010.

3) Synthetic microbe has наименьшему разработка генов, but many mysteries — популярный синопсис к обсуждаемой статье.

Александр Марков